拉里·戴雷先生（本·斯蒂勒）一直覺得自己是個做大事的人，他一直夢想著自己有一天能做個大冒險家，成就一番事業，成了老婆兒子心目中的大英雄。當然，這一切只是夢想，現在擺在眼前的是他必須在圣誕節之前找到份工作，他和妻子離婚了，如果他沒工作，兒子將被判歸已另結新歡的妻子撫養。拉里不愿讓兒子失望，于是在努力之下終于找到了一份工作，也是惟一一份，紐約自然歷史博物館的守夜人。
夜深人靜，第一次當守夜人的拉里先生手持特大號手電筒到自然歷史博物館就職。博物館的老守夜人告訴拉里說他的任務就是“確保在晚上沒有任何東西能進來博物館，同樣也要確保沒有任何東西走出博物館”。拉里覺得這個守夜人是老糊涂了，整個博物館除了他一人之外，還有什么活物能跑出去呢？從恐龍骨架到西部牛仔的拓荒史模型再到埃及金字塔，這些歷史悠久的東西擺放在整個巨大的博物館里，拉里覺得一個人晚上還逗留在這種地方，多少還是有點心里發毛。
然而，更讓他驚魂的在后頭。過了半夜，拉里突然聽見博物館走廊有聲響，他回頭一看，一個碩大的恐龍骨架竟然活了過來正咆哮著朝他蹦過來。躲過一劫的拉里發現除了恐龍之外，博物館其他的東西全都復活了：畫像中的猴子跑出來閑逛，三寸高的西部牛仔們綁架了拉里，把他放在模型鐵軌上讓火車軋，印第安勇士朝拉里投長矛。驚魂不定的拉里來不及思考為什么這些東西會動起來，他現在惟一的目的就是要讓這些東西全恢復原狀，否則他第二天肯定會被辭退。在他絞盡腦汁想辦法的時候，偉大的救星：美國史上最聰明的總統泰迪·羅斯福
先生（羅賓·威廉姆斯），陳列在博物館的總統騎馬雕像突然也復活了。在羅斯福總統指引下，拉里開始了自己夢想已久但首次遇到的冒險之旅，驚險之余笑料百出，究竟拉里能否讓發狂的博物館居民安定下來，他能否保住這份來自不易的工作？
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